10x genomics 空间转录组测序-k8凯发

 

10x 空间转录组测序

空间转录组是一种用于从空间层面上解析rna-seq数据的技术，从而解析单个组织切片中的所有mrna。
空间条形码逆转录oligo(dt)引物在显微镜载玻片表面的有序附着，使得在mrna样品处理和后续测序过程中位置信息的编码和获取成为可能。

单细胞rna测序或组织样本rna测序，均无法为研究人员提供精确的空间信息。
通过空间转录组技术可获取组织中具体位置的转录信息，为研究和诊断提供有效数据支撑。

应用方向

10x genomics空间转录组技术可以应用于肿瘤、免疫、发育、神经和病理等研究方向。




技术优势

广泛的样本适用性：适合大多数组织类型；
简单的操作流程：一个工作日内可完成从组织切片到文库的工作流程；
较高的分辨率：每个捕获区域包含 5000 个 spots，每个 spots 捕获平均 1-10 个细胞；
易于与组织学分析的实验室方法和工具集成。


实验原理
 

10x genomics空间转录组用于文库构建的每张载玻片上有四个捕获区域，每个捕获区域的大小为6.5x6.5mm，包含5000个被条形码标记的点（barcoded spots），每个点的直径为55 μm，点和点之间中心的距离为100 μm，并且每个点都有一个唯一的barcode序列。

组织切片的细胞中会释放出mrna，迁移到每个spot的mrna会被标记上相应的barcode序列，然后进行文库构建并进行测序。

最后，根据数据的条形码信息对数据进行分析，以确定哪些数据来自哪个位置，从而实现空间基因表达的可视化。

实验流程
 

10x visium的实验主要分为两部分：组织学板块和组学板块。组织学板块包括样品的包埋、切片、固定、染色及成像，记录切片的形态学信息；组学板块包括cdna的合成、扩增、接头连接和测序，记录切片的转录本信息和空间位置信息具体实验流程如下：
 

a、切片制备和优化：取新鲜组织、冷冻、切片，并进行he染色成像，优化确定切片是否覆盖靶向区域。
b、切片固定和透化：将组织切片放置在含有与rna结合捕获探针的载玻片上，并进行固定和透化，使细胞中的mrna 得到释放，并结合到相应的捕获探针上，从而获取基因表达信息。
c、逆转和文库构建：以捕获的 rna 为模板，进行 cdna 合成，和测序文库制备。
d、高通量上机测序：对制备好的测序文库，进行二代高通量短读长测序。
e、数据可视化分析：结合he结果，确定哪些基因有表达，表达量高低，以及这些基因的空间位置信息。

结果展示

t-sne降维聚类分析


左图横纵坐标分别代表t-sne降维第一和第二主成分，图中的每个点代表一个spot，
不同群的spot以不同颜色区分，右图反映的是不同群在样本空间切片位置上的具体分布，颜色与左图对应。


空间特征基因表达热图


横坐标为spot群编号，纵坐标为marker基因，图中黄色表示高表达，紫色表示低表达。



空间特征基因在t-sne聚类结果中的空间可视化图


红色越深表示该细胞中对应基因的表达量越高。
  

差异基因互作网络图


不同颜色的圆圈（或称为节点）表示具直接作用的蛋白，节点之间的连线（或称为边）表示两蛋白之间具有相互作用，线的粗细表示相互作用关系的可靠性。


常见问题
 

q1. 为什么要做空间转录组？
下图a和b是两个肿瘤组织的切片，a样本中存在淋巴细胞浸润现象，预后效果良好；而b样本淋巴细胞都被肿瘤组织阻碍在肿瘤的边缘，预后效果差。
如果只是通过常规转录组或者单细胞转录组，研究人员在两个样本中均可以发现淋巴细胞相关基因或者淋巴细胞群，无法解释两个样本预后之间的差异。但是通过空间转录组，就能很清晰看到两个样本之间的差异。

 

q2. 有哪些技术手段可以进行空间转录组研究？
已发表的关于空间转录组技术有slide-seq , lcm-seq , seqfish, merfish , liver single cell zonation , geo-seq and tomo-seq。这些方法或是在细胞数量上限制较大，或是存在有效测序深度不足等问题。
10x genomics公司提供的visium空间基因表达凯发k8国际首页的解决方案是目前唯一一个高通量空间转录组的商业化凯发k8国际首页的解决方案。该凯发k8国际首页的解决方案可以轻松地将空间转录组学技术应用到组织切片和染色的标准方法中，从而研究空间分辨率下整个转录组mrna的表达情况，同时在同一组织切片中获得组织学相关信息。

q3. 10x genomics空间转录组技术的准确性高吗？
下图是一个将10x genomics空间转录组技术应用于小鼠海马体研究的案例。a图为脑组织切片的he染色结果，从10x genomics空间转录组分析结果中，可以清晰看到tmsb4x（b图）和selenow（c图）在海马体区域高表达，和已知的研究结果一致性较高。

q4. 10x genomics空间转录组技术适用于哪些组织样本？
除了皮肤、胰腺和骨头组织外，其余样本类型均可开展10x genomics空间转录组研究。
10x genomics公司已经测试完毕的组织类型有：
人：心脏、肾脏、卵巢、乳房、淋巴结、大脑、大肠、肺、脾脏
小鼠：大脑、眼睛、心脏、肾脏、大肠、肝脏、肺、卵巢、四头肌、小肠、脾脏、胃、睾丸、甲状腺、舌头
大鼠：大脑、肾脏、心脏

q5. 基于10x genomics空间转录组技术的已发表的文献有哪些？

 

q6. 开展10x genomics空间转录组需要做哪些准备？
空间转录组是一项十分前沿的技术，涉及到很多细节方面的准备工作，例如组织类型的选择、前期预实验的设计、病理区域的确认等一系列内容。而且实验中存在很多不确定性因素，处理不慎容易导致整个项目失败。